A. 菠菜色素的提取和色素分离
一、实验目的 通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法。 通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。 二、实验原理 绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶 黄素（黄）等多种天然色素。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C 55 H 72 O 5 N 4 Mg) 和 叶绿素b(C 55 H 7 O 6 N 4 Mg) ，其差别仅是a 中一个甲基被b 中的甲酰 基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光 合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a 的含量通常是b 的3 倍。 尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于 醚、石油醚等一些非极性的溶剂。 二、实验原理 胡萝卜素(C 40 H 56 )是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体， 即a-, β - 和γ - 胡萝卜素，其中β - 异构体含量最多，也最重要。在生物体 内，β - 体受酶催化氧化即形成维生素A 。目前β - 胡萝卜素已可进行工 业生产，可作为维生素A 使用，也可作为食品工业中的色素。 叶黄素(C 40 H 56 O 2 )是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通 常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚 中溶解度较小。 二、实验原理N N N N Mg CO 2 CH 3 CH 2 O CH H 3 C H 3 C R CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH 2 C O O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3叶绿素 a (R=CH 3 )叶绿素 b (R=CHO)二、实验原理CH 3 H 3 C R CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 R H 3 C CH 3 H 3 Cβ-胡萝卜素（R=H） 叶黄素（R=OH）CH 2 OH维生素A三、基本操作与技术薄层色谱 薄层色谱常用TLC表示，又叫薄板层析，是色谱法中的一种，是 快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附 色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几 到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸 附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较 小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。此外，薄层色 谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。 薄层色谱的原理是利用吸附剂（硅胶、氧化铝等）对不同组分吸 附能力的差异从而达到分离目的的方法。 三、基本操作与技术�6�1薄层板的制备 吸附剂：最常用硅胶GF254；硅胶HF254。 粘结剂：一般用所羧甲基纤维素钠（CMC），也有用淀粉的。CMC 配成1％水溶液使用。 制板：以小板的制备为例，将硅胶加1％CMC，调成桨状（在 平 铺玻璃板上能晃动但不能流动），将其涂在载玻片上 （75 ×25），为使其坦平，可将载玻片用手端平晃动，致坦平 为止，放在干净平坦的台面上，晾干之后放入110℃烘箱 活 化1小时即可使用。 三、基本操作与技术�6�1点样 点样用的毛细管为内径＜1mm的管口平整的毛细管，将样品溶于 低沸点的溶剂（乙醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃等）配成1％溶液。 点样前，可先用铅笔在小板上距一端5mm处轻轻划一横线，作为 起始线，然后用毛细管吸取样品在起始线上小心点样，如需重复点样， 则应待前次点样的溶剂挥发后方可重点。若在同一块板上点几个样， 样品点间距离为5mm以上。 三、基本操作与技术�6�1展开 展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因 素来考虑。 薄层的展开在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放入色谱器 中（小板可用广口瓶代替），使色谱器内空气饱和5-10min，再将点好 试样的薄层板放入色谱器中进行展开，点样的位臵必须在展开剂液面 之上，当展开剂上升到薄层的前沿（离前端5-10mm）或多组分已明显 分开时，取出薄层板放平晾干，用铅笔划溶剂前沿的位臵后，即可显 色。 三、基本操作与技术�6�1显色 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色， 可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在 薄层板上划出斑点的位臵；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量 碘蒸气的容器中显色来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑 点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位臵。�6�1计算比移值 记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。 三、基本操作与技术 距离 溶剂前沿至原点中心的 点中心的距离 溶质最高浓度中心至原f R四、主要仪器与试剂仪器:研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸试剂:硅胶G ，甲醇，石油醚（60-90 ℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜叶 五、实验装臵图 薄层板在层析缸中展开 六、实验流程图 菠菜 菠菜汁 萃取液 研磨 过滤 石油醚-甲醇 萃取 浸膏 水 洗涤、蒸馏 薄层层析R f值 分别用展开剂（a ）石油醚- 丙酮=8:2 （体积比）和（b ） 石油醚- 乙酸乙酯=6:4 （体积比）展开，比较不同展开剂系 统的展开效果。 七、实验关键及注意事项薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。点样与展开应按要求进行：点样不能戳破薄层板面；展开 时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开 剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分 在薄层板上的相对位臵。 八、思考题 在一定的操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？ 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位臵？ 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？
B. 萃取-从菠菜中提取植物色素,为什么不直接用石油醚,而先要用乙醇萃取之后才用石油醚萃取
叶绿素a和b都是吡咯衍生物与金属镁的配合物，尽管它们分子中含有一些极性基团，但大的烷基结构使它们易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂溶剂。β−胡萝卜素和叶黄素是脂溶性的四萜化合物。与胡萝卜素相比，叶黄素易溶于醇而在石油醚中的溶解度较小。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。植物叶绿体色素通常可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有机溶剂提取。
C. 为什么植物色素的色谱分离大多采用含石油醚提取液，而不直接用丙酮提取液
分离原理是叶绿体中的四种色素在层析液中的扩散速度不同，如果采用丙酮作为层析液的话各种色素分子在其中溶解度差别不大，扩散速度也不存在明显差异那么就没有办法达到分离各种色素的目的。
叶绿体中的色素都能溶解于有机溶剂中，如：丙酮（酒精）等。所以可以用丙酮提取叶绿体中的色素。
叶绿体中的四种色素在层析液中的扩散速度不同，层析液的主要成分是石油醚，石油醚是一种脂溶性很强的有机溶剂，叶绿体中的四种色素在石油醚中的溶解度不同：溶解度最高的是胡萝卜素，它随石油醚在滤纸上扩散得最快；叶黄素和叶绿素a的溶解度次之；叶绿素b的溶解度最低，扩散得最慢。这样，几分钟后，四种色素就在扩散过程中分离开来。
D. 叶黄素的溶解性
叶黄素lutein 又名“植物黄体素”，在自然界中与玉米黄素共同存在。C40H56O2，属于胡萝卜醇一类的色素。吸收峰在508、475、445毫微米处（在二硫化碳中）。
溶解性：可溶解于正己烷、乙酸乙酯，不溶于水
E. 植物的颜色观
植物的颜色和色素
植物体除了有绿色外，在不同季节、不同种类和不同部位有不同的颜色。正是这些不同的颜色把大自然装点得如此绚丽多彩。
植物体的各种颜色是植物色素所赋于的。植物器官的红、橙、紫等颜色主要是类胡萝卜素和花青素所呈现的颜色。那末，不同植物和不同器官的颜色究竟是花青素所致还是类胡萝卜素所致，这需要用以下的实验进行鉴别。
取不同颜色的植物组织加水和石油醚进行研磨。滤液经过滤后，先观察上层（石油醚层）滤液的颜色和下层（水层）滤液的颜色，然后取出下层滤液分别加酸和加碱后观察颜色变化。（见下表）
部分植物色素分离及其遇酸或碱后的颜色
由于胡萝卜素和叶黄素都不溶于水而溶于石油醚等有机溶剂。而花青素易溶于水，所以上层滤液含有类胡萝卜素，下层滤液含花青素。
从以上实验，可得出以下几个结果：
1．在有些植物的红紫色组织中既含有类胡萝卜素又含有花青素，如红色香樟叶、紫红色胡萝卜根表皮、红色苹果表皮等。另些植物的红紫色组织只含有花青素，如紫鸭趾草叶、芭蕉紫色幼叶、洋葱紫红色表皮、红薯紫红色表皮、红萝卜、一串红、鸡冠花、墨菊、花竺葵、紫红色波斯菊、粉红色月季等。
2．类胡萝卜素只有黄色（叶黄素的颜色）和橙黄色（胡萝卜素的颜色）或两者共存的颜色，而没有红色色素。
3．在大多数植物的红紫色组织中都含有能在酸性条件下呈红色而在碱性条件下呈蓝色的花青素。如紫鸭趾草叶、芭蕉紫色幼叶、红色香樟叶、洋葱紫色表皮、红薯紫红色表皮、红萝卜、一串红、鸡冠花、紫红色波斯菊、粉红色月季、墨菊、红色苹果果皮等。
4．红色辣椒和红色海桐种皮中的红色素虽不在酸性条件下呈现更红的颜色或在碱性条件下呈蓝绿色，但这些色素不溶于石油醚，因此，这些红色色素不是类胡萝卜素。
5．目前普遍认为，花青素都能在酸性条件下呈现红色，在碱性条件下呈现蓝绿色，并以此为标准来判断在植物组织中是否存在花青素，或以此来解释不同颜色的花色产生的原因。事实上，红色或蓝紫色花瓣的pH都在7以下，一般为4. 5—6. 5左右。根据我们的测定，墨菊研磨液的pH值为6.5，当pH值高于6.8时，呈现蓝绿色，当pH值低于6.8时呈现褐红色；红薯红色表皮研磨液pH值为6.3，当pH值达到6.5时就出现紫色。因此不能说明蓝紫色花是细胞液呈碱性时所显现的颜色。
6．花青素的种类很多，结构也很复杂，花青素可与不同的生色团形成共轭链而使其吸收波长发生改变。花青素还可与多种金属离子形成络合物而改变其结构，使其对光的吸收波长发生改变。因此，有些结构复杂的花青素完全有可能不与酸碱发生颜色反应。实际上，早在1919年Shibata通过实验提出了一些证据对pH学说提出反驳。
F. 高一生物，关于绿叶中的色素提取和分离
醚更易挥发，且有毒，要知道乙醚就是用来当麻醉剂的。还有一点，色素在醚中的溶解度比在酒精中大。用醚提取的话，画线时纸上色素太多，层析后分离不明显。欢迎采纳~
G. 萃取绿叶色素时为什么先用乙醇再用石油醚
叶绿素a和b都是吡咯衍生物与金属镁的配合物，尽管它们分子中含有一些极性基团，但大的烷基结构使它们易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂溶剂。β−胡萝卜素和叶黄素是脂溶性的四萜化合物。与胡萝卜素相比，叶黄素易溶于醇而在石油醚中的溶解度较小。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。植物叶绿体色素通常可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有机溶剂提取。
H. 为什么在洗脱叶绿素、叶黄素和胡萝卜素三种色素时使用洗脱剂石油醚—丙酮比例不同
叶绿素、叶黄素、胡萝卜极性依次减少
因为它们分子结构中的极性含氧基团依次减少
I. 在叶绿素的萃取中，为什么石油醚可以用来做溶剂
石油醚是一种常用的有机溶剂，又能溶解叶绿素，又能挥发掉，用其他类似溶剂也可以的