A. 菠菜色素的提取和色素分離
一、實驗目的 通過綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質分離提純方法。 通過薄層色譜分離操作，加深了解微量有機物色譜分離鑒定的原理。 二、實驗原理 綠色植物如菠菜葉中含有葉綠素（綠）、胡蘿卜素（橙）和葉 黃素（黃）等多種天然色素。 葉綠素存在兩種結構相似的形式即葉綠素a(C 55 H 72 O 5 N 4 Mg) 和 葉綠素b(C 55 H 7 O 6 N 4 Mg) ，其差別僅是a 中一個甲基被b 中的甲醯 基所取代。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡合物，是植物進行光 合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a 的含量通常是b 的3 倍。 盡管葉綠素分子中含有一些極性基團，但大的烴基結構使它易溶於 醚、石油醚等一些非極性的溶劑。 二、實驗原理 胡蘿卜素(C 40 H 56 )是具有長鏈結構的共軛多烯。它有三種異構體， 即a-, β - 和γ - 胡蘿卜素，其中β - 異構體含量最多，也最重要。在生物體 內，β - 體受酶催化氧化即形成維生素A 。目前β - 胡蘿卜素已可進行工 業生產，可作為維生素A 使用，也可作為食品工業中的色素。 葉黃素(C 40 H 56 O 2 )是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通 常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶於醇而在石油醚 中溶解度較小。 二、實驗原理N N N N Mg CO 2 CH 3 CH 2 O CH H 3 C H 3 C R CH 2 CH 3 CH 3 CH 2 CH 2 C O O CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3葉綠素 a (R=CH 3 )葉綠素 b (R=CHO)二、實驗原理CH 3 H 3 C R CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 R H 3 C CH 3 H 3 Cβ-胡蘿卜素（R=H） 葉黃素（R=OH）CH 2 OH維生素A三、基本操作與技術薄層色譜 薄層色譜常用TLC表示，又叫薄板層析，是色譜法中的一種，是 快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，屬固-液吸附 色譜，它兼備了柱色譜和紙色譜的優點，一方面適用於少量樣品（幾 到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在製作薄層板時，把吸 附層加厚加大，因此，又可用來精製樣品，此法特別適用於揮發性較 小或較高溫度易發生變化而不能用氣相色譜分析的質。此外，薄層色 譜法還可用來跟蹤有機反應及進行柱色譜之前的一種「預試」。 薄層色譜的原理是利用吸附劑（硅膠、氧化鋁等）對不同組分吸 附能力的差異從而達到分離目的的方法。 三、基本操作與技術�6�1薄層板的制備 吸附劑：最常用硅膠GF254；硅膠HF254。 粘結劑：一般用所羧甲基纖維素鈉（CMC），也有用澱粉的。CMC 配成1％水溶液使用。 制板：以小板的制備為例，將硅膠加1％CMC，調成槳狀（在 平 鋪玻璃板上能晃動但不能流動），將其塗在載玻片上 （75 ×25），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動，致坦平 為止，放在干凈平坦的檯面上，晾乾之後放入110℃烘箱 活 化1小時即可使用。 三、基本操作與技術�6�1點樣 點樣用的毛細管為內徑＜1mm的管口平整的毛細管，將樣品溶於 低沸點的溶劑（乙醚、丙酮、乙醇、四氫呋喃等）配成1％溶液。 點樣前，可先用鉛筆在小板上距一端5mm處輕輕劃一橫線，作為 起始線，然後用毛細管吸取樣品在起始線上小心點樣，如需重復點樣， 則應待前次點樣的溶劑揮發後方可重點。若在同一塊板上點幾個樣， 樣品點間距離為5mm以上。 三、基本操作與技術�6�1展開 展開劑的選擇主要根據樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因 素來考慮。 薄層的展開在密閉的容器中進行。先將選擇的展開劑放入色譜器 中（小板可用廣口瓶代替），使色譜器內空氣飽和5-10min，再將點好 試樣的薄層板放入色譜器中進行展開，點樣的位臵必須在展開劑液面 之上，當展開劑上升到薄層的前沿（離前端5-10mm）或多組分已明顯 分開時，取出薄層板放平晾乾，用鉛筆劃溶劑前沿的位臵後，即可顯 色。 三、基本操作與技術�6�1顯色 如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點。如果本身無色， 可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點（有苯環的物質都有），用鉛筆在 薄層板上劃出斑點的位臵；對於在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量 碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點（因為許多化合物都能和碘成黃棕色斑 點），顯色後，立即用鉛筆標出斑點的位臵。�6�1計算比移值 記下原點至主斑點中心及展開劑前沿的距離，計算比移值（Rf）。 三、基本操作與技術 距離 溶劑前沿至原點中心的 點中心的距離 溶質最高濃度中心至原f R四、主要儀器與試劑儀器:研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶、直形冷凝管、層析缸試劑:硅膠G ，甲醇，石油醚（60-90 ℃），丙酮，乙酸乙酯，菠菜葉 五、實驗裝臵圖 薄層板在層析缸中展開 六、實驗流程圖 菠菜 菠菜汁 萃取液 研磨 過濾 石油醚-甲醇 萃取 浸膏 水 洗滌、蒸餾 薄層層析R f值 分別用展開劑（a ）石油醚- 丙酮=8:2 （體積比）和（b ） 石油醚- 乙酸乙酯=6:4 （體積比）展開，比較不同展開劑系 統的展開效果。 七、實驗關鍵及注意事項薄層層析時，薄層板的制備要厚薄均勻，表面平整光潔。點樣與展開應按要求進行：點樣不能戳破薄層板面；展開 時，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展開 劑上升高度，即無法求得Rf值和准確判斷粗產物中各組分 在薄層板上的相對位臵。 八、思考題 在一定的操作條件下為什麼可利用Rf值來鑒定化合物？ 在混合物薄層色譜中，如何判定各組分在薄層上的位臵？ 展開劑的高度若超過了點樣線，對薄層色譜有何影響？
B. 萃取-從菠菜中提取植物色素,為什麼不直接用石油醚,而先要用乙醇萃取之後才用石油醚萃取
葉綠素a和b都是吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，盡管它們分子中含有一些極性基團，但大的烷基結構使它們易溶於丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有機溶劑溶劑。β−胡蘿卜素和葉黃素是脂溶性的四萜化合物。與胡蘿卜素相比，葉黃素易溶於醇而在石油醚中的溶解度較小。根據它們在有機溶劑中的溶解特性，可將它們從植物葉片中提取出來。植物葉綠體色素通常可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有機溶劑提取。
C. 為什麼植物色素的色譜分離大多採用含石油醚提取液，而不直接用丙酮提取液
分離原理是葉綠體中的四種色素在層析液中的擴散速度不同，如果採用丙酮作為層析液的話各種色素分子在其中溶解度差別不大，擴散速度也不存在明顯差異那麼就沒有辦法達到分離各種色素的目的。
葉綠體中的色素都能溶解於有機溶劑中，如：丙酮（酒精）等。所以可以用丙酮提取葉綠體中的色素。
葉綠體中的四種色素在層析液中的擴散速度不同，層析液的主要成分是石油醚，石油醚是一種脂溶性很強的有機溶劑，葉綠體中的四種色素在石油醚中的溶解度不同：溶解度最高的是胡蘿卜素，它隨石油醚在濾紙上擴散得最快；葉黃素和葉綠素a的溶解度次之；葉綠素b的溶解度最低，擴散得最慢。這樣，幾分鍾後，四種色素就在擴散過程中分離開來。
D. 葉黃素的溶解性
葉黃素lutein 又名「植物黃體素」，在自然界中與玉米黃素共同存在。C40H56O2，屬於胡蘿卜醇一類的色素。吸收峰在508、475、445毫微米處（在二硫化碳中）。
溶解性：可溶解於正己烷、乙酸乙酯，不溶於水
E. 植物的顏色觀
植物的顏色和色素
植物體除了有綠色外，在不同季節、不同種類和不同部位有不同的顏色。正是這些不同的顏色把大自然裝點得如此絢麗多彩。
植物體的各種顏色是植物色素所賦於的。植物器官的紅、橙、紫等顏色主要是類胡蘿卜素和花青素所呈現的顏色。那末，不同植物和不同器官的顏色究竟是花青素所致還是類胡蘿卜素所致，這需要用以下的實驗進行鑒別。
取不同顏色的植物組織加水和石油醚進行研磨。濾液經過濾後，先觀察上層（石油醚層）濾液的顏色和下層（水層）濾液的顏色，然後取出下層濾液分別加酸和加鹼後觀察顏色變化。（見下表）
部分植物色素分離及其遇酸或鹼後的顏色
由於胡蘿卜素和葉黃素都不溶於水而溶於石油醚等有機溶劑。而花青素易溶於水，所以上層濾液含有類胡蘿卜素，下層濾液含花青素。
從以上實驗，可得出以下幾個結果：
1．在有些植物的紅紫色組織中既含有類胡蘿卜素又含有花青素，如紅色香樟葉、紫紅色胡蘿卜根表皮、紅色蘋果表皮等。另些植物的紅紫色組織只含有花青素，如紫鴨趾草葉、芭蕉紫色幼葉、洋蔥紫紅色表皮、紅薯紫紅色表皮、紅蘿卜、一串紅、雞冠花、墨菊、花竺葵、紫紅色波斯菊、粉紅色月季等。
2．類胡蘿卜素只有黃色（葉黃素的顏色）和橙黃色（胡蘿卜素的顏色）或兩者共存的顏色，而沒有紅色色素。
3．在大多數植物的紅紫色組織中都含有能在酸性條件下呈紅色而在鹼性條件下呈藍色的花青素。如紫鴨趾草葉、芭蕉紫色幼葉、紅色香樟葉、洋蔥紫色表皮、紅薯紫紅色表皮、紅蘿卜、一串紅、雞冠花、紫紅色波斯菊、粉紅色月季、墨菊、紅色蘋果果皮等。
4．紅色辣椒和紅色海桐種皮中的紅色素雖不在酸性條件下呈現更紅的顏色或在鹼性條件下呈藍綠色，但這些色素不溶於石油醚，因此，這些紅色色素不是類胡蘿卜素。
5．目前普遍認為，花青素都能在酸性條件下呈現紅色，在鹼性條件下呈現藍綠色，並以此為標准來判斷在植物組織中是否存在花青素，或以此來解釋不同顏色的花色產生的原因。事實上，紅色或藍紫色花瓣的pH都在7以下，一般為4. 5—6. 5左右。根據我們的測定，墨菊研磨液的pH值為6.5，當pH值高於6.8時，呈現藍綠色，當pH值低於6.8時呈現褐紅色；紅薯紅色表皮研磨液pH值為6.3，當pH值達到6.5時就出現紫色。因此不能說明藍紫色花是細胞液呈鹼性時所顯現的顏色。
6．花青素的種類很多，結構也很復雜，花青素可與不同的生色團形成共軛鏈而使其吸收波長發生改變。花青素還可與多種金屬離子形成絡合物而改變其結構，使其對光的吸收波長發生改變。因此，有些結構復雜的花青素完全有可能不與酸鹼發生顏色反應。實際上，早在1919年Shibata通過實驗提出了一些證據對pH學說提出反駁。
F. 高一生物，關於綠葉中的色素提取和分離
醚更易揮發，且有毒，要知道乙醚就是用來當麻醉劑的。還有一點，色素在醚中的溶解度比在酒精中大。用醚提取的話，畫線時紙上色素太多，層析後分離不明顯。歡迎採納~
G. 萃取綠葉色素時為什麼先用乙醇再用石油醚
葉綠素a和b都是吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，盡管它們分子中含有一些極性基團，但大的烷基結構使它們易溶於丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有機溶劑溶劑。β−胡蘿卜素和葉黃素是脂溶性的四萜化合物。與胡蘿卜素相比，葉黃素易溶於醇而在石油醚中的溶解度較小。根據它們在有機溶劑中的溶解特性，可將它們從植物葉片中提取出來。植物葉綠體色素通常可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有機溶劑提取。
H. 為什麼在洗脫葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素三種色素時使用洗脫劑石油醚—丙酮比例不同
葉綠素、葉黃素、胡蘿卜極性依次減少
因為它們分子結構中的極性含氧基團依次減少
I. 在葉綠素的萃取中，為什麼石油醚可以用來做溶劑
石油醚是一種常用的有機溶劑，又能溶解葉綠素，又能揮發掉，用其他類似溶劑也可以的